AAV誘導(dǎo)型基因表達(dá)載體結(jié)合了載體家應(yīng)用廣泛的AAV載體系統(tǒng)和Tet-On基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，幫助您在體內(nèi)體外都能進(jìn)行四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

Tet-On基因誘導(dǎo)表達(dá)載體系統(tǒng)是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)時(shí)GOI表達(dá)的強(qiáng)大工具。我們的Tet-On基因誘導(dǎo)表達(dá)載體系統(tǒng)在無(wú)四環(huán)素及其類似物（多西環(huán)素）的情況下可以做到GOI幾近完全沉默并且在加入四環(huán)素及其類似物（多西環(huán)素）的情況下快速響應(yīng)實(shí)現(xiàn)GOI表達(dá)。這是通過(guò)tTS和rtTA蛋白響應(yīng)四環(huán)素及其類似物（多西環(huán)素）的基因調(diào)控功能實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)不存在四環(huán)素及其類似物（如doxycycline）的情況下，目的基因幾乎或完全沉默；當(dāng)往體系中添加四環(huán)素或其他類似物（如doxycycline）時(shí)，目的基因得到快速高水平表達(dá)。四環(huán)素不存在的情況下時(shí)，衍生于TeR（Tet抑制蛋白）和KRAB-AB（Kid-1蛋白轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域）的融合蛋白tTS結(jié)合TRE啟動(dòng)子，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄抑制。另一方面，四環(huán)素存在時(shí)，衍生于突變型Ter抑制蛋白和VP16蛋白（轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域）的融合蛋白rtTA結(jié)合TRE啟動(dòng)子，激活基因轉(zhuǎn)錄。

AAV誘導(dǎo)表達(dá)載體首先以質(zhì)粒的方式構(gòu)建并使用E. coli擴(kuò)增，然后轉(zhuǎn)染進(jìn)入包裝細(xì)胞。在包裝過(guò)程中，位于兩個(gè)反向重復(fù)序列（ITR）之間的DNA片段與由包裝細(xì)胞表達(dá)的病毒蛋白進(jìn)一步包裝成病毒顆粒。位于兩個(gè)ITR之間的四環(huán)素誘導(dǎo)基因表達(dá)盒包含兩部分：一個(gè)四環(huán)素響應(yīng)因子（TRE）啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的用戶自定義GOI，以及一個(gè)一個(gè)廣泛?jiǎn)?dòng)子或者組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的tTS/rtTA調(diào)控蛋白。當(dāng)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞時(shí)，兩個(gè)ITR區(qū)域之間的序列和其他病毒基因組分由此進(jìn)入了靶細(xì)胞。GOI的表達(dá)可通過(guò)加入四環(huán)素啟動(dòng)。AAV包裝時(shí)的ITR序列來(lái)源于AAV2，這是一種常用的AAV載體構(gòu)建方式，不影響血清型。另一方面，決定血清型的衣殼蛋白基因由Rep/Cap包裝質(zhì)粒編碼。

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我們的Tet-On基因誘導(dǎo)表達(dá)載體系統(tǒng)在無(wú)四環(huán)素的情況下可以做到GOI幾近完全不表達(dá)，但是在加入四環(huán)素時(shí)快速表達(dá)。我們的AAV載體是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的，可在大腸桿菌中進(jìn)行高拷貝復(fù)制，是一個(gè)包裝病毒滴度高，細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，轉(zhuǎn)基因高水平表達(dá)的載體系統(tǒng)。該載體可用所有已知衣殼蛋白血清型的輔助質(zhì)粒進(jìn)行包裝，包裝出來(lái)的病毒具有非常高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且具有極高的生物安全性。

類似開(kāi)關(guān)的嚴(yán)格基因表達(dá)調(diào)控：只依賴rtTA的Tet-on系統(tǒng)在沒(méi)有誘導(dǎo)劑的情況下，會(huì)有明顯的泄露表達(dá)。我們的Tet-On基因表達(dá)載體可嚴(yán)格調(diào)控基因的表達(dá)，在沒(méi)有誘導(dǎo)劑的情況下可將背景泄露表達(dá)最小化，并保持該系統(tǒng)對(duì)四環(huán)素誘導(dǎo)的高靈敏度。

高水平表達(dá)：TRE啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)GOI在誘導(dǎo)狀態(tài)下高水平表達(dá)。

安全性：AAV是可供選擇的最安全的病毒載體，它是復(fù)制缺陷的，不會(huì)引起任何人類疾病。

對(duì)宿主基因組造成破壞的低風(fēng)險(xiǎn)性：在轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入靶細(xì)胞后，AAV病毒載體在細(xì)胞核保持著游離DNA的狀態(tài)，可以降低宿主基因組被破壞而致癌的風(fēng)險(xiǎn)，使其成為人類體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的理想載體。

高病毒滴度：利用我們的AAV病毒載體可以包裝成高滴度的病毒。我們提供的病毒包裝服務(wù)病毒滴度可達(dá)到>10¹³ GC/ml。

宿主范圍廣：針對(duì)不同來(lái)源的常用哺乳動(dòng)物（如人、小鼠和大鼠）細(xì)胞和組織，將我們的AAV載體包裝成對(duì)其具有親和性的血清型，可輕易實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)導(dǎo)。但是，某些類型的細(xì)胞仍然難以轉(zhuǎn)導(dǎo)（見(jiàn)下文不足之處），這與所用的血清型有關(guān)。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均有效：我們的載體不僅能用于體內(nèi)活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，還具有體外細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。

載體容量小：AAV是我們所有病毒載體系統(tǒng)中裝載量最小的。AAV的兩個(gè)ITR之間所能容納的最大序列長(zhǎng)度是4.7kb。在Tet-On系統(tǒng)中，用于病毒包裝、轉(zhuǎn)導(dǎo)和四環(huán)素誘導(dǎo)的基因序列另外占用2.1kb，因此留作自定義的GOI長(zhǎng)度需要小于2.6kb。

難以轉(zhuǎn)導(dǎo)特定類型的細(xì)胞：當(dāng)利用合適的血清型進(jìn)行包裝時(shí)，我們的AAV載體系統(tǒng)可以轉(zhuǎn)導(dǎo)很多不同類型的細(xì)胞，包括非分裂細(xì)胞。不同AAV血清型對(duì)不同類型的細(xì)胞具有不同的嗜性，針對(duì)某種特定類型的細(xì)胞需要特定血清型。

技術(shù)復(fù)雜：使用AAV病毒載體時(shí)，需要在包裝細(xì)胞中產(chǎn)生活病毒，然后測(cè)定病毒滴度。這些過(guò)程相對(duì)于常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，技術(shù)難度更高，周期更長(zhǎng)。在訂購(gòu)載體的同時(shí)，可以通過(guò)訂購(gòu)我們的病毒包裝服務(wù)輕松解決這些問(wèn)題。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

TRE promoter: Tetracycline-responsive element promoter (2nd generation). This element can be regulated by a class of transcription factors (e.g. tTA, rtTA and tTS) whose activities are dependent on tetracycline or its analogs (e.g. doxycycline).

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

CBh promoter: CMV early enhancer fused to modified chicken β-actin promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream tTS/rtTA cassette.

tTS: Tetracycline-controlled transcriptional silencer. This protein binds to TRE promoter to actively suppress gene transcription only in the absence of tetracycline and its analogs (e.g. doxycycline).

T2A: Self-cleaving 2A peptide from thosea asigna virus that allows multiple proteins to be made from a polycistronic transcript containing multiple ORFs separated by T2A. The cleavage occurs through a putative “ribosomal skipping” mechanism.

rtTA: Reverse tetracycline responsive transcriptional activator M2 (2nd generation). This protein binds to TRE promoter to activate gene transcription only in the presence of tetracycline or its analogs (e.g. doxycycline). It has higher sensitivity to the inducing drug and lower leaky activity in the absence of the drug compared to its predecessor.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation. It facilitates transcriptional termination of the upstream tTS/rtTA cassette.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.